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Werkzeuge des Fortschritts

Sequenzierer

An allen Standorten des Exzellenzclusters stehen den Wissenschaftlern beeindruckende Geräteparks zur Verfügung. Die Ausstattungen entsprechen dem aktuellen Stand der Technik und ermöglichen Forschungen auf allen Ebenen – von der Analyse der genetischen Varianz bis zur Funktionsuntersuchung beim Tier. Einige besondere Methoden und Techniken sind hier beispielhaft vorgestellt. 

DNA-Sequenzierer der neuen Generation

Sanger-Methode, 454-Technologie und SOLID-System – das Innenleben der Sequenziergeräte, die diese Namen tragen, kennen vermutlich nur ihre Entwickler im Detail. Für Genforscher sind sie einfach nur Werkzeuge – hochentwickelte Werkzeuge wohlgemerkt – die sie brauchen, um die Buchstabenfolge der DNA zu entziffern. Es gibt heute mehrere Verfahren zum Ablesen der Sequenzinformation von einem DNA-Molekül. Auch künftig kommen Weiterentwicklungen der Methode nach Frederick Sanger zum Einsatz. Vier solcher optimierten Sanger-Sequenzierer namens AB 3730xl gehören zur Sequenzierungsplattform am Institut für Klinische Molekularbiologie der Universität Kiel. Sehr viel mehr Möglichkeiten bieten die Sequenzierer der neueren Generation. Sie sind aus der Genomforschung heute nicht mehr wegzudenken, da sie die Ultra-Hochdurchsatz-Sequenzierung schneller und kostengünstiger erledigen. Von diesen Sequenzierern der „nächsten Generation“ wurden drei SOLiD-Geräte von Applied Biosystems sowie ein 454 (Roche FLX-Sequenzierer) angeschafft und stehen dem Cluster zur Verfügung.

Genom der Darmflora

„Mit diesen neuen Sequenziertechnologien kann man ganze Genome angehen“, erklärt Plattformleiter Markus Schilhabel. Vor allem die SOLiD-Technologie (Bild links) komme hierfür zum Einsatz. „Wir haben hier mehrere DNA Proben von Patienten, deren Genome wir komplett durchsequenzieren. Dafür brauchen Sie aber derzeit noch mehrere Runs (Durchgänge)“, berichtet Professor Andre Franke, der die bioinformatischen Analysen koordiniert Und auch für Transkriptomanalysen eigne sich das Gerät. Das heißt es lassen sich gezielt die Bereiche des Genoms erfassen, die funktionell wichtig sind. Aufbauend darauf können Aussagen über die Genaktivität und deren Regulation in verschiedenen Entwicklungsstadien und Geweben eines Organismus gemacht werden. Damit können sämtliche exprimierten Transkripte identifiziert werden und so wurden auch schon zahlreiche bis dato unbekannte Isoformen von Wissenschaftlern des Entzündungsclusters annotiert. Die 454-Technologie hingegen werde vor allem eingesetzt, um Proben mit unbekannter DNA-Sequenz aufzuschlüsseln (also keine Resequenzierung wie oben erwähnt), etwa die mikrobiologische Gemeinschaft des menschlichen Darms oder in Proben aus der Ostsee. „Auch im Meer tummeln sich viele Bakterien und auch Viren. Das war lange nicht bekannt und kam erst durch Sequenzierung von Meerwasserproben heraus.“ Die Analysetechnik hat auch ihren Preis. Abgesehen von den Anschaffungskosten in Höhe von etwa 500.000 Euro, fallen bei jedem Probendurchlauf rund 8000 Euro an. Kosten, die vor allem durch die benötigten Sequenzier-Chemikalien entstehen. Beim SOLiD erhält man dafür mehrere hundert Millionen. Sequenzen mit einer Länge von 50 Basen, beim FLX sind es circa 1 Million Sequenzen mit einer Durchschnittslänge von etwa 400 Basen.

Andre Franke

 

Andre Franke
ist seit August 2008 Juniorprofessor für Epitheliale Barrierefunktion im Exzellenzcluster Entzündungsforschung und wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Klinische Molukularbiologie. Sein Forschungsschwerpunkt ist die genetische Ätiologie chronischentzündlicher Erkrankungen des Darms und der Gallengänge.

Markus Schilhabel

 

Markus Schilhabel
ist Leiter der Sequenzierplattform am Institut für Klinische Molekularbiologie. Der Biologe leitet Schulungen zur Einführung in die Technologie und unterstützt und berät die Anwender bei den möglichen Anwendungen und Problemen.

 

Hauptarbeit kommt nach der Sequenzierung

Mit dem Auslesen der DNA-Sequenz ist es aber nicht getan. Die neuen Technologien liefern zunächst nur eine Menge an Rohdaten. Um eine Antwort auf die wissenschaftliche Fragestellung zu bekommen, müssen die Daten aber erst ausgewertet und interpretiert werden. Da ist dann die Bioinformatik gefragt. Eigens dafür entwickelte Computerprogramme fügen das für die Sequenzierung zerstückelte Genom aus den einzelnen Genfragmenten zusammen und vergleichen zum Beispiel die Buchstabenfolgen der Gensequenzen von Gesunden und Kranken. Professor Andre Franke arbeitet gerade an der Fertigstellung des ersten Genoms einer Patientin mit Morbus Crohn. Ziel dieser Arbeit ist, so Franke, Signaturen im individuellen Genom zu finden, die es ermöglichen, eine speziell für diese Person geeignete Therapie auszuwählen. In anderen Projekten gehen Kollegen aus dem Exzellenzcluster Entzündungsforschung der Darmflora auf den Grund. Dabei geht es um folgende Fragen: Welche Bakterienarten kommen wie häufig in Patienten mit Morbus Crohn vor und welche bei gesunden Kontrollpersonen? Wie variiert die Zusammensetzung innerhalb der Bakteriengemeinschaft des Darms? Und inwieweit hängt die Zusammensetzung der Darmflora von einer bestimmten genetischen Veranlagung ab? Neben Franke und seinen Kollegen vom Institut für Klinische Molekularbiologie nutzen noch viele weitere Arbeitsgruppen die hochmodern ausgestattete Sequenzierplattform.

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 Die für die Sequenzierung speziell aufbereitete DNA wird bei der 454- Technologie in circa 2 Millionen winzig kleinen Vertiefungen (Wells) der Pikotiterplatten hineinzentrifugiert (Bild unten). Jedes dieser Löcher enthält unzählige Kopien ein und desselben DNA- Fragments gebunden an einen Träger (Bead). In diesen Löchern findet die Sequenzierreaktion statt.

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Beim SOLiD-System (Bilder links)
erfolgt die Sequenzierung nicht auf
Platten, sondern auf Objektträgern.
Da sind erheblich mehr drauf (750
Millionen).

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