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Zellanalyse

Lokalisation und Transport

Das Cluster-Labor VII verfügt über eine Vielzahl von Geräten und Methoden für das Immunmonitoring und die funktionelle Immunanalyse. Hierzu zählt auch die ImageStream Cytometry. Mit dieser Kombination aus Laserscan- Mikroskop und Durchflusszytometer lässt sich zum Beispiel die Lokalisation von zentralen Molekülen, wie etwa dem TNF-Rezeptor auf und innerhalb der Zelle verfolgen.

Botenstoffe der Zelle vermitteln mitunter sehr unterschiedliche Signale, die sogar gegensätzliche Wirkung haben können. Tumornekrosefaktor (TNF), der bei lokalen und systemischen Entzündungen die Immunreaktion regelt, ist ein Beispiel für solch einen multifunktionalen Botenstoff. Die Bindung von TNF an den entsprechenden Rezeptor auf der Zelloberfläche führt einerseits über den nukleären Transkriptionsfaktor NF-κB zur Zellaktivierung, Zelldifferenzierung und Zytokinproduktion sowie zur Hemmung des programmierten Zelltodes (Apoptose). Andererseits kann die Rezeptorbindung aber auch Apoptose auslösen und zwar dann, wenn der Rezeptor mit seinem Liganden in die Zelle aufgenommen, also endozytiert wird. Bei Endozytose des TNF-Rezeptors legt die Zelle quasi einen Schalter um, die wachstumsfördernden Signale werden abgeschaltet und stattdessen erhält die Zelle das Signal zum Absterben.

Die Arbeitsgruppe von Professor Stefan Schütze am Institut für Immunologie der Kieler Universität hat maßgeblich zum Verständnis dieser zweigeteilten TNF-Wirkung beigetragen. Sie hat gezeigt, dass der Zelltod durch so genannte „Todesvesikel“ vermittelt wird, die bei Aufnahme der Rezeptoren in die Zelle entstehen. Die Vesikel reifen in den Zellen und interagieren mit Proteinen, die das Signal zum programmierten Zelltod verstärken. Nun geht es darum, die Grundlagen für die Verlagerung des TNF-Rezeptors von außen nach innen zu verstehen. „Normalerweise würde man erwarten, dass die Zelle überleben will“, verdeutlicht Schützes Mitarbeiter Dr. Jürgen Fritsch. „Das heißt, wenn TNF am Rezeptor bindet, dann werden in erster Linie über NF-kB Signale zur Proliferation und zum Überleben der Zelle vermittelt. An einem bestimmten Punkt findet ein „Switch“ statt, der zum Überwiegen des Signals für Apoptose führt. Wie und an welchem Punkt es zu dieser Änderung der Signalgebung des TNF-Rezeptors kommt wollen wir ausloten“, erklärt Fritsch.

Stefan Schütze
ist stellvertretender Direktor und Arbeitsgruppenleiter am Institut für Immunologie der Christian- Albrechts-Universität zu Kiel. Forschungsschwerpunkte: molekulare Analyse intrazellulärer Signalwege von Zytokinen, Moleküle des Sphingolipid-Metabolismus, Regulationsmechanismen des programmierten Zelltodes.

Jürgen Fritsch
ist wissenschaftlicher Mitarbeiter am Institut für Immunologie der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Der Biologe beschäftigt sich vor allem mit der Kompartimentierung von Signalwegen.



Wertvolle Dienste bei dieser Forschung liefert die ImageStream Cytometry. Das Gerät kombiniert die Fluoreszenz-Mikroskopie mit der Durchflusszytometrie und ermöglicht damit die Analyse großer Zellmengen sowie die detaillierte Darstellung einzelner Zellen. Damit können je nach Vorbehandlung der Proben eine Vielzahl von Vorgängen in der Zelle wie zum Beispiel Signalwege, Internalisierung und Phagozytose, intrazelluläre Kolokalisationen verschiedener Proteine, Zell-Zell-Interaktionen oder Zelltod untersucht werden.

Das Untersuchungsmaterial wird mit fluoreszierenden Farbstoffen behandelt, zum Beispiel mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen bestimmte Zellstrukturen. Die Zell-Suspension wird von dem Gerät aufgenommen und anschließend werden die Zellen nacheinander an einem Laserstrahl/Fluoreszenzdetektor vorbeigeführt und von jeder Zelle wird ein hochaufgelöstes Fluoreszenz-mikroskopisches Bild aufgenommen. Die Lokalisation der unterschiedlich angefärbten Zellbestandteile kann so studiert werden. Fritsch: „Für uns ist es wichtig, die Lokalisation von Molekülen zu beobachten. Mit dem Gerät kann angeschaut werden, zu welchem Zeitpunkt sich ein bestimmtes Molekül in welchem Kompartiment der Zelle befindet. Außerdem kann man analysieren, ob zu einem bestimmten Zeitpunkt eine gehäufte Ko- Lokalisation mit einem speziellen Marker auftritt. Das heißt, man kann den Transport oder die Reifung etwa von Organellen innerhalb einer Zelle verfolgen.“

 

Messung mit dem ImageStream
In diesem Experiment wurde die Internalisierung des TNF-Rezeptors (TNF-R1) in Kontrollzellen (shKontrolle) und speziell vorbehandelten Zellen (RNF8 defiziente-Zellen, shRNF8) untersucht. TNF-R1 wurde grün, die Plasmamembran rot markiert. In den Kontrollzellen liegt der Rezeptor zunächst deutlich an der Zelloberfläche (0 min) und nach 40 Minuten Inkubation intrazellulär vor. Bei RNF8-defizienten Zellen findet dagegen keine Endozytose des Rezeptors statt, die grünen Fluoreszenzen bleiben auf der Zelloberfläche. Im oberen Teil des Bildes sind für jeden Zustand (Oberfläche versus intrazellulär) zwei Zellen exemplarisch dargestellt. Der untere Teil des Bildes zeigt die Quantifizierung der Messung.

Auf diese Weise haben die Kieler Immunologen zum Beispiel die Lokalisation des TNF-Rezeptors unter bestimmten Bedinungen untersucht, um zu beobachten, wann er endozytiert wird und wann nicht. „Wir haben den Rezeptor auf der Zelloberfläche grün markiert und die Zellmembran rot. Damit konnten wir ermitteln, wieviel Prozent der Zellen den Rezeptor noch an der Zelloberfläche haben und wieviel Prozent ihn endozytiert haben“, so Fritsch. Herausgefunden hat die Arbeitsgruppe zum Beispiel, dass Zellen, bei denen ein bestimmtes Protein ausgeschaltet wurde, den Rezeptor nicht mehr endozytieren. In diesen Zellen können also keine Signale zur Auslösung der Apoptose weitergeleitet werden.
Die Internalisierung und Reifung dieser so genannten Rezeptosomen wird auch in Zukunft weiter untersucht. „Wir haben über ein Proteom-Screening neue Moleküle entdeckt, die vermutlich an der Reifung beteiligt sind. Das wollen wir im ImageStream analysieren.“ Dazu werden die entsprechend vorbereiteten Zellen zu bestimmten Zeiten gezählt, aufgenommen und hinsichtlich der Ko-Lokalisation mit den jeweiligen Molekülen analysiert. „Wir erwarten, dass die Proteine vorübergehend zu dem TNF-Rezeptosom rekrutiert werden und dann möglicherweise wieder dissoziieren, sobald sie ihre Aufgabe erfüllt haben.“

 

Steckbrief Cluster-Labor VII

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